问答题试述包含体复性的基本过程，复性过程错误发生的主要原因是什么？举例分析主要的复性方法的优缺点，为什么LC复性是最好的？

题目

问答题

试述包含体复性的基本过程，复性过程错误发生的主要原因是什么？举例分析主要的复性方法的优缺点，为什么LC复性是最好的？

参考答案和解析

正确答案：包含体复性的基本过程：
①分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
②洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（TritonX-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。
③溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去污剂可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂用来螯合Cu²⁺、Fe³⁺等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
复性过程错误发生的主要原因是：在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。
复性方法的优点：透析、稀释和超滤复性法，这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。
复性方法的缺点：复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。
LC复性是最好的原因：与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：
①在进样后可很快的除去变性剂；
②色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在
脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；
③在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；
④便于回收变性剂，降低废水处理成本。

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第1题：

建立企业模型时，确定业务活动的目的是

A．找出重复性活动

B．找出重复性过程

C．找出被遗漏的过程

D．确定业务职能

正确答案：C

第2题：

PCR扩增技术中，一个扩增的基本循环顺序是

A、复性→变性→扩增

B、变性→复性→扩增

C、变性→扩增→复性

D、扩增→复性→变性

E、扩增→变性→复性

参考答案：B

第3题：

有关核酸的变性与复性的说法正确的是( )。

A、热变性后相同的DNA经缓慢降温冷却后可以复性

B、热变性的DNA迅速降温的过程称为退火

C、所有DNA分子变性后，在合适的温度下都可以复性

D、热变性的DNA迅速冷却后即可再结合为双链

E、复性的最佳温度时64℃

参考答案：A

第4题：

有关核酸的变性与复性的叙述正确的是（）

A.热变性后相同的两条单链DNA经缓慢冷却后可复性
B.不同的DNA分子变性后，在合适温度下都可复性
C.热变性的DNA迅速降温过程也称作退火
D.复性的最佳温度为25℃

答案：C

解析：

第5题：

企业建模型的业务活动确定的目的是( )。

A．找出重复性活动

B．找出重复性过程

C．找出被遗漏的过程

D．确定业务职能

正确答案：A

第6题：

PCR扩增的基本循环顺序是

A、复性→变性→扩增

B、变→复性→扩增

C、变性→延伸→复性

D、复性→扩增→变性

E、延伸→变性→复性

参考答案：B

第7题：

企业建模的业务活动确定的目的是

A．找出重复性活动

B．找出重复性过程

C．找出被遗漏的过程

D．确定业务职能

正确答案：A
解析：在企业建模时，业务活动过程确定以后，针对每个过程再细化分解其活动，即将企业职能的功能进一步分解到最低层的执行操作为止。按活动绘制出企业的结构图，标明企业活动与数据之间的关系。因为，在企业不断的扩充过程中，各部门独立进行，并不了解有许多活动在其他部门中已有建立，从而造成许多重复性活动，也就带来了许多重复性数据管理，这对计算机信息系统来说，必须注意克服，否则对系统的维护要付出昂贵的代价。因此，活动确定对于信息系统减少冗余数据，改进管理组织机构均有重要的作用。

第8题：

技术生产过程具有()。

A.非重复性

B.重复性

C.批量

D.不确定性

参考答案：A

第9题：

DNA退火的含意是

A、热变性的DNA维持原温度即可复性

B、热变性的DNA在降温过程中可复性

C、热变性的DNA经加热处理后即可复性

D、热变性的DNA经酸处理后即可复性

E、热变性的DNA经酶切后即可复性

参考答案：B

第10题：

有关核酸的变性与复性的正确叙述为

A.热变性后序列互补的DNA分子经缓慢冷却后可复性
B.热变性后的DNA复性的最适pH为9. 5
C.热变性后的DNA迅速降温过程也称作退火
D.热变性后的DNA复性的最佳温度为25°C

答案：A

解析：

试述包含体复性的基本过程，复性过程错误发生的主要原因是什么？举例分析主要的复性方法的优缺点，为什么LC复性是最好的？

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