原核表达系统常用的有大肠杆菌、谷草芽孢杆菌和链霉菌，真核表达系统常用的有（）、（）

题目

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第1题：

真核基因在大肠杆菌中以什么形式表达?

参考答案：融合蛋白。

第2题：

如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。

正确答案: 大肠杆菌是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。由于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度，修主细胞蛋白酶对蛋白质的降解等等原因，因此并非每一种基因都能在大肠杆菌中有效表达。下面浅谈一下实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达的策略。
首先，要构建有效的表达载体，一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。构建表达载体，需要仔细考虑多种元件的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
a、提高转录水平调控的策略
（1）选择的启动子要具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强；第二，它必须表现最低水平的基础转录活性。若要求高效的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。
（2）现在已鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列，有可能利用增强子来达到超量表达蛋白质的目的。（3）虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。
b、提高翻译水平调控的策略
（1）mRNA5’末端的独特结构是mRNA翻译起始效率的最主要决定因素，因此找到通用的有效起始翻译的共同序列能高效起始外源蛋白的翻译。
（2）SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，这一距离影响翻译起始的效率，因此在设计载体中要控制好这段距离。（3）在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用，使用一些策略使mRNA形成二级结构的可能性最小。
（4）mRNA的快速降解势必影响蛋白质的产生，比如可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达，这将在E.coli高效表达外源基因中有很大作用。
（5）在mRNA中存在终止信号是翻译终止过程必不可少的，在设计表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃，在E.coli中偏向于使用UAA密码子。
c、维护真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞稳定性和减少E.coli中重组蛋白裂解的策略
（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基
（2）在较低的温度下培养细菌
（3）选用蛋白酶缺陷的菌株
（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。
（5）将目的基因多拷贝串联
（6）与分子伴侣共表达
（7）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点
（8）改善蛋白质的亲水性
（9）优化培养条件，E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高，
d、提高真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞分泌的策略
（1）将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。
（2）对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。
质粒的构建，SD序列，信号肽，糖基化，启动子

第3题：

蛋白质的体外表达系统大体上可分为( )

A、细菌表达系统与病毒表达系统

B、昆虫表达系统与酵母表达系统

C、酵母表达系统与病毒表达系统

D、原核表达系统与真核表达系统

E、哺乳动物表达系统与细菌表达系统

参考答案：D

第4题：

真核生物基因表达系统有什么特点？

正确答案: 由于原核生物缺少翻译后的加工系统，所以在很多情况下，人们不得不采用真核细胞表达系统，最常用的真核表达宿主是酵母菌。有时由于被表达基因的特殊性，也可用植物细胞、动物细胞和昆虫细胞作为真核表达系统。

第5题：

比较原核生物和真核生物基因表达调控的异同。

正确答案: （1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：
a.结构基因均有调控序列；
b.表达过程都具有复杂性，表现为多环节；
c.表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性；
（2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点：
a.真核生物基因表达调控过程更复杂；
b.基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等；
c.转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性；
d.转录后加工过程；
e.正负调控机制；
f.RNA聚合酶种类多。

第6题：

下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（）

A、大肠杆菌－繁殖迅速
B、枯草杆菌－分泌机制健全
C、链霉菌－遗传稳定
D、酵母菌－表达产物具有真核性

正确答案:C

第7题：

原核表达系统中不包括（）。

A、金黄色葡萄球菌
B、大肠杆菌
C、芽孢杆菌
D、蓝藻
E、链霉菌

正确答案:A

第8题：

基因表达最常用的宿主菌是()

A、链霉菌

B、枯草芽孢杆菌

C、大肠杆菌

D、酵母

参考答案：C

第9题：

基因工程中原核表达常用的宿主有（）、枯草杆菌等；常用的真核表达系统有（）、动物（植物）细胞等

正确答案:大肠杆菌；酵母

第10题：

基因表达的主要控制元件有哪些，真核生物和原核生物有何差别？

正确答案: 基因表达的主要控制元件有启动子、核糖体结合位点、转录终止信号等。启动子：原核启动子约55bp，分为起始点（start site）、结合部位、识别部位。起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G，A。结合部位：约6bp组成，是高度保守区，共有序列为5’-TATAAT-3’ ，位于起始点上游-10。因Tm低，DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。识别部位：约6bp组成，在-35处，为高度保守区，序列5’-TTGACA-3’， s因子识别此部位。
真核启动子于-25处含AT富集区，共有序列为TATAA（TATA box），-70处含共有序列CAAT ，还含许多其它box ，例如 GC box，E-box等。含增强子（enhancer）和静息子（silencer） RNA polⅠ和 RNA polⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。
核糖体结合位点：在大肠杆菌等原核生物mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。
转录终止信号：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。原核生物终止信号在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决于DNA的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质（p因子）的参与。
真核生物转录终止序列，在3’端之后有共同序列AATAAA及多个GT序列，mRNA在转录终止序列处被切断。

原核表达系统常用的有大肠杆菌、谷草芽孢杆菌和链霉菌，真核表达系统

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