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如何实现一个外源基因在体外表达？

题目
问答题
如何实现一个外源基因在体外表达？
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相似问题和答案

第1题：

外源基因的瞬时表达


正确答案:外源基因的瞬时表达是指转化的外源基因通常在数小时后就能检测到其表达的产物，即检测到新合成的蛋白质或酶的活性，并在1～2天内达到最高价，随后又逐渐降低，到十多天后完全消失。

第2题：

有关逆转录病毒载体描述错误的是（）。

  • A、可以容纳7kb以外的外源基因
  • B、是一种没有危险性的基因治疗载体
  • C、可以高效整合
  • D、不整合
  • E、有利于让外源基因在靶细胞中永久表达

正确答案:B,D

第3题：

外源基因克隆至一个合适的载体,首先导入体外培养的自体或异体的细胞,经筛选后将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者体内称之为()

A、直接活体转移

B、回体转移

C、间体转移

D、导入

E、移植


参考答案：B

第4题：

中断源如何表达中断请求？


正确答案:一般是设置中断请求触发器，在需要 CPU服务时，将中断请求触发器置位，其“1” 端或“0”端输出的跳变作为中断请求信号。

第5题：

如何实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达。


正确答案: 大肠杆菌是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。由于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度，修主细胞蛋白酶对蛋白质的降解等等原因，因此并非每一种基因都能在大肠杆菌中有效表达。下面浅谈一下实现真核生物一蛋白基因在大肠杆菌细胞中受控、稳定、分泌和高效表达的策略。
首先，要构建有效的表达载体，一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。构建表达载体，需要仔细考虑多种元件的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。
a、提高转录水平调控的策略
（1）选择的启动子要具有适合高水平蛋白质合成的某些特性。首先启动子的作用要强；第二，它必须表现最低水平的基础转录活性。若要求高效的基因表达，最好选用高密度培养细胞和表现最低活性的可诱导和非抑制启动子。
（2）现在已鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列，有可能利用增强子来达到超量表达蛋白质的目的。（3）虽然转录终止子在表达质粒的构建过程中常被忽略，但有效的转录终止子是表达载体必不可少的元件。
b、提高翻译水平调控的策略  
（1）mRNA5’末端的独特结构是mRNA翻译起始效率的最主要决定因素，因此找到通用的有效起始翻译的共同序列能高效起始外源蛋白的翻译。
（2）SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，这一距离影响翻译起始的效率，因此在设计载体中要控制好这段距离。（3）在mRNA的翻译起始区的二级结构在决定基因表达效率方面具有重要作用，使用一些策略使mRNA形成二级结构的可能性最小。
（4）mRNA的快速降解势必影响蛋白质的产生，比如可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达，这将在E.coli高效表达外源基因中有很大作用。
（5）在mRNA中存在终止信号是翻译终止过程必不可少的，在设计表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃，在E.coli中偏向于使用UAA密码子。
c、维护真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞稳定性和减少E.coli中重组蛋白裂解的策略
（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基
（2）在较低的温度下培养细菌
（3）选用蛋白酶缺陷的菌株
（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；融合系统能够产生大量的可溶性的融合蛋白，为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便。
（5）将目的基因多拷贝串联
（6）与分子伴侣共表达
（7）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点
（8）改善蛋白质的亲水性
（9）优化培养条件，E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高，
d、提高真核生物蛋白基因在大肠杆菌细胞分泌的策略 
（1）将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。
（2）对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解。
质粒的构建，SD序列，信号肽，糖基化，启动子

第6题：

转基因植物中外源基因的存在问题：外源基因在后代中的遗传多样性和外源基因在后代中表达的（）。


正确答案:不确定性

第7题：

提高外源基因在大肠杆菌中表达水平的措施有（）。

  • A、调整SD序列与ATG之间的距离
  • B、用点突变的方法改变起始密码子下游的几个密码子
  • C、增加mRNA的稳定性
  • D、使细菌的生长与外源基因的表达分开
  • E、提高表达蛋白的稳定性

正确答案:A,B,C,D,E

第8题：

影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素有哪些?


答案：
解析：
(1)启动子的强弱(2分);(2)基因的剂量(2分);(3)影响RNA转录和翻译效率的因素:SD序列mRNA(2分);(4)外源基因密码子的选择(2分);(5)表达产物的大小和稳定性(2分,以上五点均需进-步展开)。

第9题：

与微生物细胞相比较，利用动物细胞表达外源基因具有的缺点是（）

  • A、不能生长含糖链的活性物质
  • B、表达的蛋白质的立体结构有错误
  • C、动物细胞培养更复杂
  • D、不能表达原核细胞基

正确答案:C

第10题：

利用基因动物作为外源基因的表达系统与体外细胞表达系统相比有什么优点？


正确答案: 在体外细胞表达系统中基因产物的产量通常较低，特别是跨膜蛋白，因为它在转染细胞的膜上积累，从而妨碍蛋白的进一步积累，而在乳液分泌中，乳腺细胞中合成的脂被质膜包在囊内，然后一起以球状颗粒的形式分泌到乳液中。利用这一原理，蛋白质的产量提高，而且浓缩纯化也更加容易。

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